МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ИЗУЧЕНИЮ МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
ПРИ ОБОСНОВАНИИ ИХ ПДК В ВОДЕ

РАЗРАБОТАНЫ под руководством проф. Г.Н.Красовского и к.м.н. В.С.Журкова сотрудниками Ордена Трудового Красного Знамени НИИ общей и коммунальной гигиены им. А.Н.Сысина АМН СССР к.м.н. В.С.Журковым, проф. Г.Н.Красовским, к.м.н. З.И.Жолдаковой. Раздел исследований на сальмонелле подготовлен д.б.н. Л.М.Фонштейном, к.б.н. С.А.Абилевым, Е.В.Бобриневым, М.А.Подольной, Н.Г.Облапенко (НИИпоБИХС Минмедпрома СССР); к.б.н. А.М.Дуганом (НИИОКГ им. А.Н.Сысина АМН СССР). При составлении рекомендаций использованы материалы к.б.н. В.В.Соколовского, к.б.н. Е.Г.Фельдт, Л.П.Сычевой (НИИОКГ им. А.Н.Сысина АМН СССР); В.В.Юрченко (ВНИИ дезинфекции и стерилизации МЗ СССР); к.м.н. Р.А.Рязановой (МНИИГ им. Ф.Ф.Эрисмана МЗ РСФСР); Е.Ю.Кагана (КНИИОКГ им. А.Н.Марзеева МЗ УССР); С.П.Сайченко (Свердловский НИИГТиПЗ).     

УТВЕРЖДЕНЫ Заместителем Главного государственного санитарного врача СССР А.И.Заиченко 12 июня 1986 г. N 4110-86

Методические указания предназначены для специалистов НИИ и СЭС, занимающихся экспериментальным обоснованием ПДК вредных веществ в воде. Они определяют общие принципы и методические особенности изучения мутагенной активности химических веществ и регламентации в воде водных объектов соединений, показавших мутагенный эффект, с целью повышения надежности гигиенических нормативов в интересах здоровья населения.

1. Введение

Повышение точности и надежности гигиенических нормативов с обязательным учетом отдаленных эффектов - актуальная задача гигиены. Одним из опасных видов отдаленных эффектов является способность вызывать наследуемые изменения генетического материала - мутации. Мутации в половых клетках могут приводить к спонтанным абортам, мертворождениям, врожденным порокам развития, к увеличению частоты наследственных заболеваний. Мутации в соматических клетках связаны с процессами канцерогенеза, старения, с нарушениями эмбрионального развития и др. Необходимость учета мутагенных эффектов при гигиеническом регламентировании химических соединений связана с двумя моментами: возросшей долей наследственной патологии в общей патологии человека и накоплением экспериментальных данных о способности ряда веществ индуцировать мутации у различных организмов.

Однако при гигиенической оценке химических агентов, загрязняющих воду, не всегда учитывается их мутагенная активность. Это в значительной мере связано с недостаточностью методических разработок, с отсутствием четко разработанной стратегии и тактики проведения исследований. Цель настоящих рекомендаций - дать схему исследований мутагенной активности веществ, объекты и методы исследований и подходы к их регламентированию в воде с учетом мутагенной активности.

2. Общие положения

2.1. Анализ мутагенной активности веществ, поступающих в воду, является составной частью исследований по гигиеническому обоснованию ПДК.

2.2. Этапы исследований должны соответствовать этапам установления гигиенических ПДК химических веществ в воде водных объектов (Г.Н.Красовский и соавт., 1979).

2.3. Необходима оценка мутаций в соматических и половых клетках млекопитающих.

2.4. Анализ зависимости "доза-эффект" в исследованиях на млекопитающих.

2.5. Определение на каждом этапе обязательных и дополнительных (факультативных) методов. К последним относятся методы, результаты которых имеют такое же значение, как и результаты обязательных методов, но в силу методических сложностей, высокой трудоемкости не могут в настоящее время широко использоваться в практике. Следует отметить, что с развитием экспериментальной генетики могут появиться методы или приемы, которые позволят факультативные или перспективные методы перевести в обязательные.

2.6. Используемые методы требуют высокой квалифицированной подготовки и должны проводиться сотрудниками, прошедшими специализацию в этой области.

3. Методическая схема изучения мутагенной активности химических загрязнителей воды

Рекомендуемая схема обязательных исследований представлена в таблице 1.

Таблица 1

     
Этапная схема изучения мутагенной активности химических веществ, загрязняющих воду

_______________

* Г.Н.Красовский и соавт., 1979.

** Методические рекомендации, 1981 (Учет рецессивных мутаций на дрозофиле; анализ СХО в клетках человека). Методические рекомендации, 1974 (Учет хромосомных аберраций в лимфоцитах). Методические рекомендации, 1978 (Ана-телофазный анализ).

3.1. Этап I - выявление мутагенов.

Необходимость этапа определяется следующими моментами: сравнительно небольшим числом изученных на мутагенность соединений из общего числа нормированных в воде; данными о том, что около 5-10% химических агентов в окружающей среде проявляют мутагенную активность. Методы, используемые на этом этапе, должны быть информативны, просты и нетрудоемки. В качестве обязательных методов рекомендованы: 1. анализ данных литературы; 2. полуколичественный метод учета генных мутаций на S.typhimurium; 3. анализ частоты полихроматофильных эритроцитов с микроядрами в костном мозге мышей (микроядерный тест).

3.1.1. Анализ данных литературы

В настоящее время в литературе постоянно накапливаются данные по изучению мутагенной активности химических веществ на разных тест-объектах. Наиболее информативны данные, полученные в наблюдениях на человеке (эпидемиологические исследования, учет частоты хромосомных аберраций и сестринских хроматидных обменов в лимфоцитах), в опытах на млекопитающих, на культивируемых клетках человека и млекопитающих, на дрозофиле и на S.typhimurium и Е.соIi с использованием системы метаболической активации. Сведения о канцерогенном эффекте вещества также указывают на его возможную мутагенную активность. Наибольшее количество данных можно найти в реферативных журналах ВИНИТИ: РЖБ 04Т "Цитология. Общая генетика"; РЖ 72 "Охрана природы и воспроизводство природных ресурсов"; РЖ 73 "Онкология" раздел "Канцерогенез"; РЖ 75 "Токсикология"; РЖ 40 "Генетика человека". Если данные литературы свидетельствуют о мутагенной активности вещества, то его исследуют на этапе II. При отсутствии или противоречивых данных проводятся экспериментальные исследования этапа I.

3.1.2. Полуколичественный метод учета мутаций Salmonella/микросомы (тест Эймса)

Наиболее широко применяемым методом выявления мутагенной активности химических веществ является тест Эймса Salmonella/микросомы. Сущность метода (Ames et al., 1973) заключается в регистрации способности химического вещества или его метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов S.typhimurium. Индикаторные штаммы вместе с исследуемым веществом, гомогенатом печени крыс и кофакторами (НАДФ, глюкозо-6-фосфат) вносят в слой верхнего полужидкого агара на чашки Петри. Под влиянием ферментов гомогената печени млекопитающего в результате функционирования системы микросомального окисления вещество может претерпевать ряд метаболических превращений. Если вещество или его метаболиты обладают мутагенной активностью, то увеличивается количество колоний-ревертантов на чашку по сравнению с контролем.

Проведение экспериментов можно организовать на базах микробиологических лабораторий. Подробно методики изложены в ряде руководств (Л.М.Фонштейн и соавт., 1997., Ames et al., 1975). Ниже будут изложены основные этапы проведения экспериментов и учета результатов.

Индикаторные штаммы. В экспериментах рекомендуется использовать гистидинзависимые штаммы S.typhimurium ТА 1535, ТА 1538, ТА 98 и ТА 100. Эти штаммы несут мутации ауксотрофности по гистидину. Наличие мутагенного эффекта у исследуемого препарата учитывается по индукции обратных мутаций от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Характеристики штаммов, правила их ведения и проверки генотипов изложены в вышеуказанных руководствах. Штамм ТА 1535 выявляет соединения, индуцирующие мутации типа замены оснований, штаммы ТА 1538 и ТА 98 - мутации типа сдвига считывания генетического кода, штамм ТА 100 - мутации, образующиеся по обоим механизмам. Использование данного набора штаммов позволяет регистрировать как факт индукции мутаций, так и молекулярный механизм действия мутагенов.

Проведение эксперимента.

Необходимые для опытов оборудование, реактивы, питательные среды, растворы, проведение работ по получению гомогената печени крыс, компоненты активирующей смеси, а также регламент работ с бактериальными культурами описаны в работах Л.М.Фонштейна и соавт. (1977) и Ames et al. (1975).

Для опытов используют свежеприготовленную ночную культуру. Культуру центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 минут и ресуспендируют в буферном растворе до плотности 2-3х10 клеток на 1 мл.

Исследуемые вещества растворяют в стерильной дистиллированной воде или диметилсульфоксиде до концентраций 1, 10, 100, 1000 и 10000 мкг/мл. Селективный полуобогащенный 0,6% агар в пробирках плавят в водяной бане при 100 °С и помещают в термостатированную водяную баню при 45-46 °С.

Микросомальная активирующая смесь готовится следующим образом: в 1 мл смеси должно содержаться 0,1-0,3 мл фракций S-9, 4мМ НАДФ, 5мМ глюкозо-6-фосфата, 33мМ , 8мМ М и 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,4 до 1 мл. В случае тестирования полициклических ароматических соединений в смесь вносят 0,1 мл фракции S-9 печени крыс, которым предварительно вводили метилхолантрен (однократно, 40 мг/кг внутрибрюшинно за 48 часов до забоя) для индукции микросом. При тестировании других групп соединений в смесь вносят 0,3 мл фракции S-9 печени крыс, которым вводили в качестве индуктора фенобарбитал (в течение 3 дней по 80 мг/кг внутрибрюшинно). Данные объемы вносимой в активирующую смесь фракции S-9 соответствуют количеству микросомального белка на чашку, оптимальному при тестировании большинства групп химических соединений (Belser et al., 1981).

В пробирки с полужидким агаром вносят 0,1 мл раствора исследуемого вещества (конечные дозы 0,1, 1,0, 10, 100, 1000 мкг на чашку); 0,1 мл суспензии бактерий; 0,5 мл микросомальной активирующей смеси. Содержимое пробирки быстро размешивают и выливают на слой нижнего минимального агара на чашке Петри. Продолжительность времени внесения активирующей смеси и разливка полужидкого агара должна быть не более 10-15 секунд. Полужидкий агар должен покрыть поверхность чашки ровным слоем. Чашки оставляют при комнатной температуре 30-40 минут и после полного застывания переносят в термостат при 37 °С. Учет результатов (подсчет числа колоний-ревертантов на чашке) проводят через 48 часов инкубации.

Параллельно в опыт включают варианты с полной микросомальной смесью (ПМАС) и неполной микросомальной активирующей смесью (НМАС). В состав первой входят: S-9 фракция гомогената печени крыс и кофакторы; второй - вместо кофакторов вносят соответствующий объем воды. В вариантах с НМАС регистрируются мутагены, проявляющие эффект непосредственно. В вариантах с ПМАС выявляется эффект метаболитов вещества. В контрольных вариантах используют соответствующий растворитель.

Эксперимент сопровождают позитивными контролями со стандартными мутагенами. Для штаммов ТА 1535 и ТА 100 при НМАС - нитрозометилмочевина (100 мкг/чашку) или тиофосфамид (200 мкг/чашку); для штаммов ТА 1538 и ТА 98 при НМАС - ДДДТДП (100 мкг/чашку) (Абилев и соавт., 1979) или 2-нитрофлуорен (100 мкг/чашку). Активность гомогената контролируют, используя циклофосфан (500 мкг/чашку) на штаммах ТА 1535 и ТА 100 параллельно в вариантах с ПМАС и НМАС при работе с фенобарбитал-индуцированными микросомами, или бенз(а)пирен или 2-ацетиламинофлуорен (10 мкг/чашку) на штаммах ТА 1538, ТА 100 и ТА 98 при работе с 3-метилхолантрен-индуцированными микросомами. Необходимым условием возможности учета результатов является наличие мутагенного эффекта во всех вариантах позитивных контролей, а также в контроле на активность гомогената.

В каждом опытном и контрольном вариантах используют по 3 чашки. Статистическая обработка данных проводится по методу множественных сравнений Даннета (Dunnett, 1955) (табл.2). Эффективность и рациональность этого метода по сравнению с методами попарного сравнения опытных и контрольных вариантов выражается прежде всего в снижении частоты ложно-положительных результатов, поскольку вероятность ошибки I рода (обычно принимаемая за 5%) задается для всего эксперимента, а не для каждой отдельной группы. Метод предполагает оценивание случайной дисперсии () по всем исследованным дозам в варианте (НМАС или ПМАС каждого штамма), что увеличивает точность оценки и разрешающую способность метода.

Таблица 2

Значения для сравнения опытных групп с контрольной (Dunnett, 1955)